1 m TRIS PH8 recept na lasagne

• Přístup

• 6 Citace

• Podrobnosti metriky

Pozadí

Jedlé zlato (Au) se běžně používá jako potravinářská přísada (E v EU) pro ozdoby cukrovinek a dortů, polevy a v nápojích. Potravinářské zlato se nejčastěji skládá z tenkých Au plátů nebo vloček vykazujících mikro- a nanometrické rozměry ve své tloušťce. Obavy z dopadu minerálních částic používaných jako potravinářské přísady na lidské zdraví rostou s ohledem na konkrétní fyzikálně-chemické vlastnosti nanočástic, které jim umožňují překračovat biologické bariéry a interagovat s různými kompartmenty tělesných buněk. V této studii byli samci a samice myší denně vystaveni E nebo nanomateriálu Au (Ref-Au) přimíchanému do potravy v příslušné lidské dávce po dobu 90 dnů, aby se určila potenciální toxicita jedlého zlata.

výsledky

Expozice E nebo Ref-Au u myší nevyvolala žádné histomorfologické poškození jater, sleziny nebo střeva, ani žádné genotoxické účinky v tlustém střevě a játrech, a to navzdory zjevné vyšší úrovni střevní absorpce částic Au u myší vystavených Ref-Au ve srovnání s potravinovou přídatnou látkou E. Po léčbě přípravkem Ref-Au nebyly hlášeny žádné změny ve střevní mikroflóře, bez ohledu na pohlaví. Naproti tomu po expozici E bylo pozorováno zvýšení poměru Firmicutes/Bacteroidetes a množství proteobakterií u žen, zatímco u obou pohlaví došlo ke snížení produkce mastných kyselin s krátkým řetězcem. Kromě toho byla pozorována zvýšená produkce IL-6, TNFα a IL-1β v tlustém střevě myších samic na konci dne expozice E, zatímco snížené hladiny IL-6, IL-1β, IL a TGFβ byly zjištěny v tlustém střevě samce.

Závěry

Tyto výsledky odhalily, že denní expozice E přidanému do stravy mění střevní mikrobiota a střevní imunitní odpověď způsobem závislým na pohlaví u myší. V dávkovém rozmezí expozice člověka E zůstaly tyto změny nízké u obou pohlaví a většinou se zdály být netoxické. Při vyšší dávce by však pozorovaná střevní dysbióza a střevní zánět nízkého stupně u myších samic mohly podpořit výskyt metabolických poruch podporujících stanovení toxických referenčních hodnot pro bezpečné používání zlata jako potravinářské přídatné látky.

Zlato (Au) se běžně používá jako potravinářská přídatná látka (v EU označovaná jako E) pro zdobení cukrovinek, dortů, čokolád a likérů. Stejně jako u jiných potravinářských přídatných látek, jako je E (oxid titaničitý) nebo E (stříbro), je potravinářský Au složen z mikro- a/nebo nanočástic a je reprezentativní pro vyráběné látky, které přispívají ke každodenní expozici člověka nanočásticím prostřednictvím stravy [1,2,3]. Spotřeba produktů obsahujících E vede k průměrnému dennímu příjmu Au dosahujícímu až μg/kg tělesné hmotnosti (TH)/den (d) u dětí a odhaduje se, že pravděpodobně dosahuje až μg/kg TH/d napříč všemi skupinami populace [4, 5]. Navzdory nedostatku relevantních toxikologických údajů byla spotřeba E vědeckou komunitou pro potraviny považována za přijatelnou a nebyl stanoven žádný přijatelný denní příjem [5, 6]. Rostou obavy z potenciálního zdravotního rizika spojeného s přítomností nanočástic (NP) v potravinářských výrobcích, protože by mohly mít škodlivé účinky na zdraví prostřednictvím změny střevní flóry, integrity střevní bariéry a vývoje a chování mozku [7,8,9,10,11]. Tyto účinky potenciálně souvisejí s konkrétními fyzikálně-chemickými vlastnostmi NP, které jim umožňují procházet biologickými bariérami, jako je střevo, hematoencefalická bariéra a placenta [12,13,14]. Evropská komise požádala o vědecké stanovisko k přehodnocení používání jedlého zlata (E) jako potravinářské přídatné látky, které poukázalo na absenci údajů o chronické toxicitě E [5]. U většiny publikovaných studií byl kladen důraz na in vitro toxikologické účinky spojené s expozicí Au-NP, což naznačuje nelineární cytotoxicitu závislou na velikosti [15], genotoxicitu [16, 17] nebo buněčnou absorpci [18, 19]. Na druhou stranu, vzhledem k jejich potenciálnímu využití pro terapeutické aplikace jako nanonosiče [20] většina provedených studií in vivo zdůrazňovala biodistribuci sloučenin a zdůrazňovala biodistribuci a vylučovací cesty související s velikostí [21,22,23,24,25,26], se silným vlivem povrchových charakteristik a způsobu podání [27,28,29]. Pokud jde o toxikologické účinky spojené s expozicí Au-NP in vivo, jsou zaznamenány nesrovnalosti mezi studiemi na hlodavcích, přičemž reakce se pohybují od nulového účinku až po úbytek hmotnosti, prozánětlivé reakce a tvorba granulomu v játrech nebo vysoká mortalita [29,30,31,32]. Ani nanomodely (% NP) ani použité metody podávání (např. intravenózní nebo intraperitoneální injekce) však nejsou reprezentativní pro riziko potravin, s nímž se setkává běžná populace, tj. chronickou perorální expozici při nízkých dávkách směsi mikro- a nanočástic, jak je zjištěno v potravinářské přídatné látce E. Studie toxicity Au-NP by skutečně měly vzít v úvahu expozici potravinovým Au-NP, tj. Erelated, konzumovaným denně populací prostřednictvím stravy.

Po požití jsou Au-NP schopny interagovat s bakteriemi ze střevní mikroflóry [33] před průchodem přes střevní epiteliální bariéru [29, 33,34,35] a interagovat s lokálními a systémovými imunitními buňkami [36,37,38]. Střevní sliznice představuje komplexní rozhraní účastnící se homeostatického vztahu mezi střevní mikrobiotou a imunitním systémem hostitele u reakce na prostředí a stravu [39,40,41]. Střevní mikrobiota skutečně hraje klíčovou roli v mnoha fyziologických funkcích, jako je energetický metabolismus, střevní imunita a vývoj mozku [41,42,43,44]. Recipročně střevní epiteliální buňky a imunitní systém regulují a formují střevní mikrobiotu [40, 41, 45]. Přeslechy mezi mikrobiotou a hostitelskými buňkami jsou složité a zahrnují bakteriální metabolity, jako jsou mastné kyseliny s krátkým řetězcem (SCFA) a ligandy aryl uhlovodíkového receptoru (AhR), které jsou nezbytné pro udržení funkcí střev, nervového systému a jater [46,47,48,49]. Mnoho chronických onemocnění u lidí je spojeno se změnami podél osy mikrobiota a imunitního systému, jako je zánětlivé onemocnění střev a metabolické poruchy [50]. Na základě pozorování, že Au-NP vykazují antibakteriální aktivity [51], jsme předpokládali, že chronická orální expozice potravinářskému Au (E) by také mohla změnit mikrobiota-imunitní systém, což vede k dysbióze a/nebo střevnímu zánětu s možnými zdravotními následky. Navíc, protože byly zaznamenány rozdíly související s pohlavím ve složení střevní mikrobioty a imunitních reakcích [52,53,54], mohl by existovat sexuální dimorfismus s ohledem na dopady E na osu střevní mikrobioty a imunitního systému, což vede k náchylnosti k rozvoji onemocnění související s pohlavím. V této souvislosti bylo cílem této studie na myších prozkoumat střevní a systémovou (slezina a játra) biodistribuci potravinářské přídatné látky E a určit potenciální fyziologický dopad chronické expozice E v příslušných lidských dávkách na trávicí trakt (střevní tolerance, včetně střevní mikrobioty), přičemž je třeba vzít v úvahu potenciální sexuální dimorfismus. Zvláštní pozornost byla věnována velikosti částic testovacího prášku E ve srovnání s referenčním (Ref) testovacím nanomateriálem Au.

Fyzikálně-chemické vlastnosti částic Au

Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) a transmisní elektronická mikroskopie (TEM) ve spojení s energeticky disperzním rentgenovým zářením (EDX) prokázaly, že E prášek byl složen z fragmentů zlatých fólií, které se blížily čistotě (obr. 1A, B). Průměrná tloušťka fragmentů zlatých fólií z E byla ± nm s distribucí tloušťky velikosti v rozmezí od 60 do nm a 28 % nanoobjektů podle počtu bylo pojmenováno nanodestičky, protože pouze jeden rozměr byl menší než nm (obr. 1C). Podle výrobce měly Au-NP použité v této studii (Ref-Au) kulovitý tvar a distribuce velikosti částic se pohybovala od 50 do nm. Nanočástice z Ref-Au se blížily čistotě se specifickým povrchem m ² /g (obr. 1D, E). Niklový pík pozorovaný v EDX spektrech E a Ref-Au pocházel z mřížky, která podpírala částice pro mikroskopickou analýzu (obr. 1B, E).

Chování zvířat, spotřeba krmiva a hmotnost těla a orgánů

Aby bylo možné určit potenciální toxicitu potravinářského Au (E), byli samci a samice myší vystaveni po dobu 13 týdnů E zabudovaný do potravinových pelet při příslušných úrovních dávky pro člověka a 1 μg/kg žhm/den a při vysoké úrovni dávky 10 μg/kg ž.hm/den. Pro účely srovnání potenciálního vlivu částic Au na velikost byly skupiny samců a samic myší ošetřeny nanomateriálem Au o % nanovelikosti (Ref-Au) začleněným do potravinových pelet při vyšší úrovni dávky 10 μg/kg TH/d. Kontrolní samci a samice myší byli krmeni neošetřenou stravou. Během experimentu se všechny myši zdály být zdravé a u myší léčených přípravkem E nebo Ref-Au nebylo pozorováno žádné abnormální chování. Denní příjem krmiva u myších samců a samic vystavených E nebo Au-NP byl po celou dobu expozice podobný jako u kontrolní skupiny s výjimkou dne 3 po zahájení expozice, kdy byl denní příjem krmiva u myších samců a samic vystavených E a 1 μg/kg TH/d významně snížen ve srovnání s kontrolními myšmi (obr. 2A, B). Byl také pozorován pokles denního příjmu krmiva u myších samic vystavených Ref-Au ve srovnání s kontrolní skupinou 3. den po začátku expozice (obr. 2B). Tyto modulace v denním příjmu krmiva pozorované pouze 3 dny po zahájení léčby neměly žádný vliv na tělesnou hmotnost a přírůstek tělesné hmotnosti samců a samic myší (obr. 2C, D a doplňkový soubor 1: obr. S1A, B). Absolutní hmotnost jater a sleziny byla také podobná u léčených a kontrolních myší bez ohledu na pohlaví (ANOVA, p > ) (Tabulka 1). Průměrné expoziční dávky E a Ref-Au byly stanoveny pomocí zaznamenané spotřeby pelet a tělesné hmotnosti. Efektivní příjem krmiva byl 90 % a % cílového příjmu pro samce a samice myší, což ukazuje, že průměrné expoziční dávky E a Ref-Au byly velmi blízké cílovým expozičním dávkám (tabulka S1).

tkáňová distribuce

Konfokální mikroskopie pro vizualizaci kovových částic spojená s TEM–EDX analýzou byla použita ke sledování distribuce Au v trávicím traktu, játrech a slezině u kontrolních myší nebo myší vystavených po dobu 13 týdnů Ref-Au a nejvyšší dávce E (10 μg/kg TH/d). Zatímco v trávicím traktu kontrolních myší nebyly zjištěny téměř žádné částice, přítomnost laserově odrážejících kovových částic byla pozorována v lamina propria klků jejuna, v jádrech imunitních buněk z Peyerovy skvrny a v lumen tlustého střeva myší krmených denně potravou obsahující nanomateriál Ref-Au (Doplňkový soubor 1: Obr. S2–4). Na řezech tkání TEM z myší vystavených Ref-Au byly anorganické částice pozorovány také ve střevním lumen, v mikroklcích a cytoplazmě enterocytů jejuna, jakož i v mikroklcích M buněk vystýlajících kopuli Peyerova skvrna a v epiteliálních buňkách tlustého střeva (enterocyty a pohárkové buňky produkující hlen) (Doplňkový soubor 1: Obr. S5–7). Částice byly také nalezeny v oblastech vystýlajících krevní cévy v části tlustého střeva (doplňkový soubor 1: obr. S7). Chemické prvkové mapování pomocí TEM–EDX potvrdilo přítomnost Au na usazeninách částic pozorovaných v trávicím traktu myší léčených Ref-Au (obr. 3A–C).

myší vystavených v plné velikosti (10 μg/kg BW/d) byly pozorovány některé kovové částice odrážející laser v lumen jejuna a v jádrech imunitních buněk z Peyerova plátna, zatímco v lumen tlustého střeva nebyly pozorovány žádné nebo vzácné částice (doplňkový soubor 1: obr. S2–4). TEM analýza tkáňových řezů myší vystavených E ukázala, že elektronově husté anorganické částice byly nalezeny ve střevním lumen, v mikroklcích a v cytoplazmě enterocytů jejuna, stejně jako v blízkosti jádra imunitních buněk v Peyerových plátech a v jádře buněk umístěných v lamina propria tlustého střeva (Doplňkový soubor 1: Obr. S8–10). Přítomnost Au mezi částicemi pozorovanými TEM byla potvrzena v řezech jejuna a tlustého střeva (Fig. 3D, E). V analyzovaných částicích v Peyerových skvrnách nebyl detekován žádný Au signál (Doplňkový soubor 1: Obr. S9). Částice se zotavily v Peyerových skvrnách myší vystavených E byly převážně složeny z křemíku (Si) a/nebo mědi (Cu) (Doplňkový soubor 1: Obr. S9). Zajímavé je, že mezi částicemi analyzovanými EDX v trávicím traktu myší vystavených Ref-Au nebo E byly kromě Au často nalezeny částice obsahující Si a titan (Ti) (Fig. 3D a doplňkový soubor 1: Obr. S9).

Distribuce zlata byla měřena také v játrech a slezině, aby se zjistilo, zda se částice Au ze stravy obsahující nanomateriál Ref-Au nebo potravinářského zlata (E) dostaly do systémového oběhu a hromadily se v těchto orgánech. V játrech kontrolních a léčených myší nebyly pozorovány žádné nebo vzácné kovové částice, zatímco některé kovové částice odrážející laser byly získány v portálním prostoru blízko jaterní interlobulární tepny myší ošetřených nanomateriálem Ref-Au (doplňkový soubor 1: Obr. S11). TEM–EDX analýza navíc potvrdila přítomnost Au na usazeniny částic pozorované v játrech myší léčených Ref-Au (obr. 3F a doplňkový soubor 1: obr. S12). V analyzovaných částicích v játrech myší vystavených E nebyl pozorován žádný Au signál (doplňkový soubor 1: Obr. S13). Několik elektronově denzních anorganických částic pozorovaných v cytoplazmě hepatocytů myší vystavených E se skládalo z Cu a vápníku (Ca) (doplňkový soubor 1: Obr. S13).

Ve slezině kontrolních myší nebyly nalezeny žádné nebo jen málo kovových částic odrážejících laser, zatímco některé fluorescenční kovové částice byly pozorovány v lumen cévního lumen sleziny nebo translokovány uvnitř slezinné tkáně myší léčených Ref-Au- a Etreated (doplňkový soubor 1: Obr. S14). Analýza TEM–EDX odhalila přítomnost několika elektronově denzních anorganických částic se signály Au v cytoplazmě imunitních buněk ve slezině myší léčených Ref-Au, zatímco ve vzácných elektronově denzních anorganických částicích nebyl detekován žádný signál Au nalezený ve slezině myší vystavených E (obr. 3G a doplňkový soubor 1: obr. S15, 16).

Celkově tyto výsledky ukázaly, že částice Au se translokovaly v tenkém a tlustém střevě po 13 týdnech expozice nanomateriálu Ref-Au nebo E Přítomnost částic Au v játrech a slezině zdůraznila systémový průchod nanočástic Au ze střeva u myší léčených Ref-Au. Naproti tomu u myší, které byly po dobu 13 týdnů vystaveny dávce E překračující desetinásobek vysoké úrovně expozice pro člověka ve scénáři posouzení maximální úrovně expozice ve vědeckém stanovisku EFSA pro zlato (E) jako potravinářskou přídatnou látku, nebyl pozorován žádný důkaz o systémovém průchodu částic Au.

Histopatologické výsledky, genotoxicita a střevní permeabilita

Vzhledem k tomu, že částice Au byly nalezeny v tenkém a tlustém střevě myší vystavených E a Ref-Au, jakož i v játrech a slezině myší léčených Ref-Au, histopatologické Změny v H&E barvených řezech, genotoxicita a střevní permeabilita byly hodnoceny za účelem stanovení potenciálních změn v těchto orgánech. U jejuna, tlustého střeva, jater nebo sleziny zvířat s Ref-Au- a Eexposed nebyly identifikovány žádné histopatologické léze související s léčbou ve srovnání s kontrolními myšmi (obr. 4A–E).

Navíc denní orální expozice Ref-Au a E nevyvolala zvýšenou fosforylaci γH2AX, biomarkeru genotoxicity, v tlustém střevě a játrech samců a samic myší (obr. 5A–D). Stejně tak nebylo pozorováno žádné zvýšení střevní permeability ani změna integrity epitelu na konci léčby Ref-Au nebo E u samců a samic myší (obr. 5E–L). Mírně a významně snížená propustnost lumen-slizničního permeanu FITC-dextranu byla zaznamenána v ileu mužů léčených E při dávce 1 μg/kg BW/d ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 5E). Tento pokles toku dextranu byl doprovázen nemodifikovanou hodnotou TER (obr. 5F). V navíc se snížená epiteliální permeabilita pro FITC-dextran nevyskytla v závislosti na dávce (podobný trend na vysoké úrovni dávky, ale ne významný). Tyto mírné změny lze považovat za související s léčbou vitaminem E, ale vzhledem k absenci odpovědi na dávku (tok dextranu a TER) a vzhledem ke snížené bazální permeabilitě spíše než ke zvýšení, nebyl tento účinek považován za škodlivý. Celkově tyto údaje ukazují, že expozice Ref-Au nebo E nenarušuje integritu střevní bariéry. Kromě toho systémová distribuce dříve pozorovaných nanočástic zlata není spojena s genotoxickými účinky v játrech.

Střevní imunitní odpověď

Přítomnost Au částice ve střevních tkáních myší vystavených Ref-Au nebo E by mohly naznačovat, že částice Au mohou interagovat se střevními imunitními buňkami. Abychom zjistili, zda denní expozice Ref-Au nebo E ovlivňuje střevní imunitní odpověď, hodnotili jsme expresi a produkci pro- a protizánětlivých cytokinů v tlustém střevě myší. Hodnoceny byly také hladiny fekálního lipokalinu (Lcn)-2, který se používá jako obecný střevní zánětlivý marker [55].

Ve srovnání s hladinou v kontrolní skupině byl u samic myší vystavených E, která nedosáhla významnosti (ANOVA, p > ) zaznamenán na dávce závislý trend směrem ke zvyšování hladin Lcn-2 ve stolici (ANOVA, p ) (doplňkový soubor 1: obr. S17A). Podobně nebyly pozorovány žádné rozdíly ve stolicích hladin Lcn-2 u myších samců bez ohledu na zvažovanou léčbu (doplňkový soubor 1: Obr. S17B).

Nejpozoruhodnější je, že u pacientů s vysokou teplotou byla pozorována snížená produkce prozánětlivých cytokinů IL-1β, IL-6 a IL tlustého střeva myších samců vystavených všem dávkám E (obr. 6A, B, E). Toto snížení hladin IL-1β sledovalo vzorec závislý na dávce, který nebyl hlášen pro IL-6 a IL (obr. 6A, B, E). V souladu s tím byla zaznamenána významná downregulace genové exprese IL-1β u myších samců vystavených E (doplňkový soubor 1: Obr. S18A). Naproti tomu nebyly pozorovány žádné rozdíly v expresi genu IL nebo v expresi a sekreci TNFα, bez ohledu na úroveň dávky E (obr. 6C a doplňkový soubor 1: Obr. S18B, D). U myších samců byla produkce prozánětlivého cytokinu IFNγ v tlustém střevě významně zvýšena při dávce μg/kg BW/d E bez změny odpovídající genové exprese (obr. 6D a doplňkový soubor 1: obr. S18C). Denní expozice E také ovlivnila protizánětlivou odpověď v tlustém střevě myších samců prostřednictvím snížené produkce cytokinu TGFβ po expozici potravinářské přídatné látce v dávkách 1 a 10 μg/kg BW/d (obr. 6F). Bez ohledu na dávku E se nevyskytly žádné rozdíly v expresi genu TGFβ ani v expresi a produkci protizánětlivého cytokinu IL (obr. 6G a doplňkový soubor 1: obr. S18E, F). Pokud jde o dopad denní expozice Ref-Au u myších samců, byl pozorován významný pokles exprese IL-1β a IL bez vlivu na produkci proteinu (obr. 6A, G a doplňkový soubor 1: obr. S18A, F). Navíc byla hlášena snížená produkce cytokinu TGFβ v tlustém střevě myších samců léčených Ref-Au, zatímco genová exprese tohoto protizánětlivého mediátoru zůstala nezměněna (obr. 6F a doplňkový soubor 1: obr. S18E).

myších samic vedla denní expozice Ref-Au ke snížení produkce prozánětlivého cytokinu TNFα v tlustém střevě (obr. 6J). Ačkoli podobný klesající trend byl pozorován také u genové exprese TNFα ve sliznici tlustého střeva myších samic vystavených Ref-Au, tento efekt nebyl významný (doplňkový soubor 1: Obr. S18H). Tato zjištění byla paralelně spojena s vyšší sekrecí IL-6 a TNFα v tlustém střevě myších samic vystavených 1 μg/kg BW/d E bez změny exprese TNFα ve srovnání s kontrolními myšmi (obr. 6I, J a doplňkový soubor 1: Obr. S18H). Kromě toho bylo hlášeno zvýšení sekrece prozánětlivého cytokinu IL-1β u myších samic vystavených E a 1 μg/kg BW/d, zatímco hladina IL-1β se nelišila od hladiny kontrolní skupiny při nejvyšší dávce E (obr. 6H a doplňkový soubor 1: obr. S18G). Genová exprese IL-1β v tlustém střevě myších samic sledovala vzorec závislý na dávce podobný jako na úrovni proteinu, ale zvýšená exprese tohoto prozánětlivého cytokinu byla statisticky významná pouze při střední dávce E (doplňkový soubor 1: Obr. S18G). Genová exprese prozánětlivého cytokinu IL byla také významně zvýšena u myších samic vystavených 1 μg/kg BW/d E ve srovnání k regulaci myší, ale nedošlo k žádné změně v sekreci IL (obr. 6L a doplňkový soubor 1: obr. S18J). A konečně, genová exprese a produkce proteinů protizánětlivých cytokinů IL a TGFβ ve sliznici tlustého střeva myších samic vystavených E se významně nelišily od genové exprese a produkce proteinů u kontrolních myší (obr. 6M, N a doplňkový soubor 1: obr. S18K, L).

Celkově tyto výsledky ukázaly, že denní orální expozice Ref-Au nebo E modulovala střevní imunitní odpověď sexuálně dimorfním způsobem. U myších samců, s výjimkou zvýšené hladiny IFNγ hlášené pouze při nejnižší dávce E, byla na konci léčby E snížena produkce prozánětlivých cytokinů IL-6, IL-1β a IL a také protizánětlivého cytokinu TGFβ. Naproti tomu podobná perorální expozice E u myších samic vyvolala zvýšenou produkci prozánětlivých cytokinů IL-6, TNFα a IL-1β. Navíc perorální expozice Ref-Au vyvolala snížení produkce TNFα pouze u myších samic. Tyto změny ve střevní imunitní odpovědi pozorované u obou pohlaví byly potenciálně způsobeny interakcí částic Au se střevní mikrobiotou a/nebo střevními imunitními buňkami.

Účinky expozice E na střevní aktivitu AhR

Naše výsledky ukázaly, že denní expozice E vyvolala sníženou produkci IL ve sliznici tlustého střeva u myších samců. Jedním z mechanismů, který by mohl tato zjištění spojit, je modulace aryl uhlovodíkového receptoru (AhR) mikrobiotou v gastrointestinálním traktu. Indolové deriváty generované metabolismem tryptofanu střevní mikrobiotou skutečně hrají roli ve slizniční imunitní odpovědi prostřednictvím AhR modulací imunitních buněk, které produkují IL [56, 57]. Zkoumáním aktivace AhR fekální mikrobiotou jsme tedy schopni vyhodnotit schopnost mikrobioty vyvolat produkci IL střevní imunitou buňky. Pomocí systému hlášení AhR jsme zjistili, že výkaly samců myší vystavených E byly defektní ve své schopnosti aktivovat AhR (obr. 7A). V souladu s absencí modulace IL pozorovanou ve sliznici tlustého střeva myších samic po expozici E nebo Ref-Au, nebyla kapacita fekální mikrobioty aktivovat AhR u léčených myší samic odlišná ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 7B).

Souhrnně tyto výsledky ukázaly, že snížená produkce IL pozorovaná v tlustém střevě myších samců vystavených E by mohla částečně souviset se sníženou schopností fekální mikrobioty produkovat deriváty schopné aktivovat AhR. Tento defekt v aktivaci AhR střevní mikrobiotou byl specificky pozorován u myších samců a potvrdil pohlavní dimorfismus zaznamenaný ve střevní produkci IL po orální expozici složení

a funkci E Fekální mikrobioty

. Systémová absorpce Au-NP je u hlodavců nízká [34, 35] a naznačuje, že většina přijatých Au-NP se hromadí v lumen střeva, Podporuje trvalý kontakt částic se střevními bakteriemi. Kromě toho, na základě pozorování, že Au-NP a související vedlejší produkty vykazují antibakteriální aktivity [51], by chronická perorální expozice Au-NP nebo jejich odpovídajících potravinových forem mohla změnit střevní mikrobiotu, což vede k dysbióze. Proto je dopad Byla zkoumána subchronická perorální expozice Ref-Au nebo E na složení a aktivitu fekální mikrobioty.

Hlavní souřadnicová analýza odhalila rozdíl v profilech fekální mikrobioty mezi samci a samicemi myší, bez ohledu na uvažované experimentální podmínky (doplňkový soubor 1: Obr. S19A). Na základě tohoto pozorování pohlavního dimorfismu ve složení střevní mikrobioty u dospělých myší byla provedena následná analýza u každého pohlaví nezávisle.

Expozice Ref-Au neovlivnila bohatost střevních bakteriálních komunit u myších samců, zatímco významný nárůst byl pozorován u samic myší po expozici vyšší dávce E (obr. 8A, H). Kromě toho analýza beta diverzity u samic a samců myší pomocí Brayových–Curtisových vzdáleností ukázala významný nárůst rozdílů v četnosti bakteriální komunity mezi kontrolní a exponovanou skupinou bez ohledu na dávku léčby (obr. 8B, I; Doplňkový soubor 1: Obr. S19B, C).

Fekální mikrobiota kontrolních a exponovaných samců a samic myší byla dominantně zastoupena zástupci kmenů Firmicutes, Bacteroidetes a Proteobacteria (doplňkový soubor 1: Obr. S19D, E). U exponovaných myších samců nebyly zjištěny žádné změny střevní mikrobioty související s léčbou na úrovni kmene nebo rodu (obr. 8C–G). U myších samic nebyly pozorovány žádné rozdíly ve složení fekální mikrobioty na úrovni kmene po expozici Ref-Au, zatímco kmeny Bacteroidetes a Actinobacteria byly významně sníženy po expozici nejvyšší dávce E, z čehož těží kmeny Firmicutes a Proteobacteria (obr. 8J–M). V důsledku toho bylo pozorováno významné zvýšení poměru Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) po expozici E při 10 μg/kg BW/d (obr. 8N). Kromě toho bylo množství Bifidobacterium (rod) významně sníženo u myších samic vystavena E při 1 a 10 μg/kg BW/d a abundance Akkermansia muciniphila (druh) byla zvýšena po expozici Ref-Au a E při 1 a 10 μg/kg BW/d (obr. 8O, P).

Abychom získali přehled o funkčních rozdílech mezi střevní mikrobiotou exponovaných a neexponovaných samců a samic myší, prozkoumali jsme metabolickou aktivitu fekální mikrobioty pomocí ¹ H-NMR analýzy. Tento přístup umožňuje detekci 40–50 metabolitů, z nichž většina je produkována buď metabolismem střevní mikrobioty, nebo společným metabolismem střevní mikrobioty hostitele a střeva.

Metabolomika založená na ¹ H-NMR ukázala, že denní expozice Ref-Au vyvolala významné změny v metabolických profilech stolice u samců (doplňkový soubor 1: obr. S20A, B), ale ne u myších samic (doplňkový soubor 1: obr. S20C, D). Ortogonální projekce na latentní strukturně diskriminační analýzu (O-PLS-DA) významně diskriminovala muže vystavené Ref-Au od kontrolních samců (model O-PLS-DA: ^{Q 2} Y = ). Metabolické profily myších samců ošetřených nanomateriálem Ref-Au se od kontrolní skupiny lišily především zvýšenou úrovní produkce aspartátu (obr. 9G a doplňkový soubor 1: obr. S20B).

Po 90 dnech expozice E při μg/kg BW/d nebyl pomocí statistického modelu O-PLS-DA zjištěn žádný významný rozdíl ve srovnání s kontrolní skupinou pro obě pohlaví (model O-PLS-DA: ^{Q 2} Y = ) (obr. 9A a 10A, D). Analýza diskriminačních metabolitů však odhalila vyšší hladiny aspartátu u myších samců léčených nízkou dávkou E ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 9D, G). Kromě toho byla pozorována jasná diskriminace mezi metabolickými profily kontrolní skupiny ve srovnání se samci a samicemi myší vystavenými 1 a 10 μg/kg BW/d E (obr. 9B, C a 10B, C). Ve srovnání s kontrolní skupinou vykazovali samci vystavení 1 μg/kg BW/d E vyšší hladiny aspartátu a mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem ve stolici (MCFA) a nižší hladiny acetátu a propionátu, což jsou mastné kyseliny s krátkým řetězcem (SCFA) (Obr. 9E, G–J). Analýza diskriminačních metabolitů u samců vystavených dávce 10 μg/kg BW/d E ukázala vyšší hladiny aspartátu a nižší hladiny acetátu a MCFA než u myší, kterým nebyly vystaveny (obr. 9F, G–J).

U myších samic vystavených dávce 1 a 10 μg/kg BW/d E byly metabolické profily odlišeny od kontrolních myší hlavně nižšími hladinami acetátu a propionátu (obr. 10B, C, E–I). Zvýšená hladina MCFA byla také pozorována u žen vystavených dávce 1 μg/kg BW/d E ve srovnání s neléčenými kontrolami (obr. 10I).

Celkově tyto výsledky ukazují, že subchronická expozice Ref-Au není dostatečná k vyvolání významných změn mikrobiálního složení výkalů u mužů a žen, což naznačuje omezený účinek nanočástic Au při vysoké dávce. Naproti tomu složení střevní mikrobioty a produkce metabolitů zapojených do fyziologie hostitele, jako jsou SCFA, byly změněny u samců a samic myší vystavených E. Tyto změny mikrobioty vyvolané požitím E byly výraznější u samic myší, s negativním posunem v mikrobiální komunitě, což podporuje růst patogenních bakterií, jako je Proteobakterie na úkor prospěšných kmenů, jako je Bifidobacterium .

Diskuze Jedlé zlato (Au) se skládá ze smíšených tenkých plátů nebo vloček elementárního Au o velikosti nano- a mikronů [58]. Tato studie na myších zkoumala střevní absorpci a potenciální toxicitu potravinářské přídatné látky E po expozici příslušným dávkám pro člověka. Zvláštní pozornost byla věnována účinkům souvisejícím s velikostí částic ve srovnání s čistým nanomateriálem Au (zde Ref-Au, tj. % složeným z nanočástic). Aby byla zajištěna relevance pro hodnocení rizik u lidí [59], byly částice zlata (E) potravinářské kvality a Ref-Au začleněny do pevné potravinové matrice (pelety pro hlodavce) a myši byly vystaveny po dobu 13 týdnů prostřednictvím stravy. Nebyla pozorována žádná mortalita a evoluce tělesné hmotnosti se zdála být konzistentní a podobně zvýšená ve všech skupinách, což naznačuje žádnou zjevnou toxicitu Au-NP nebo E přísada v testovaných dávkách. Kromě toho nebylo pozorováno žádné histomorfologické poškození jater, sleziny a střeva související s léčbou nebo genotoxické účinky v tlustém střevě a játrech u žádné sloučeniny ve studii orální toxicity na konci týdne. Dosud bylo provedeno několik studií orální toxicity částic Au na potkanech nebo myších za použití vysokých koncentrací potažených nebo nepotažených Au-NP (20–17, μg/kg ž.hm/den) podávaných ve vodní suspenzi žaludeční sondou po kratší dobu (mezi 1 a 28 dny) [29, 33,34,35, 60, 61]. Byly hlášeny protichůdné výsledky, některé studie prokázaly žádnou nebo nízkou toxicitu na základě tělesné a orgánové hmotnosti, stejně jako na histopatologické, hematologické a sérové biochemické analýze [29, 33,34,35, 60], zatímco jiné odhalily hlubší změny v některých z těchto parametrů [29, 37, 61]. Rozdíly v druzích zvířat, délce expozice, dávce, velikosti, tvaru a povlaku Au-NP mohou být přispívají k těmto nesrovnalostem. Kromě toho, zatímco studie in vivo na hlodavcích dospěly k závěru, že orální Au-NP vstoupily do krevního řečiště a hromadily se v ledvinách a játrech [29, 33,34,35], tyto podmínky při použití vysokých dávek a sférických nanomodelů nejsou reprezentativní pro expozici E u lidí, ke které dochází při velmi nízkých dávkách požitých tenkých fólií nebo větších plátů, z nichž některé mají rozměry < nm na tloušťku (tj. nanodestičky).

V naší studii po třinácti týdnech perorální expozice E přidanému do potravinových pelet byly částice Au běžně nalezeny v lumen jejuna a tlustého střeva léčených myší, zatímco v játrech a slezině nebyl prokázán žádný prvek Au. Toto pozorování zdůraznilo téměř chybějící průchod zlata ze střeva do krve z potravinářské přídatné látky, což je situace, která kontrastuje s léčbou Au-NP zde získanou v játrech a slezině myší vystavených Ref-Au. Bylo prokázáno, že částice zlata procházejí střevní epitel in vitro s difúzní kapacitou závislou na velikosti, což zdůrazňuje vyšší permeabilitu pro Au-NP než pro jejich mikročásticové formy [62]. V souladu s tím naše studie in vivo potvrdila systémový průchod Au-NP u myší vystavených čisté nanohmotě, zatímco u myší vystavených potravinářské přídatné látce E, která se skládala hlavně z větších částic Au, nebyla pozorována žádná podobná translokace. Je rozumné dojít k závěru, že fyzická forma jedlého zlata v naší šarži E, kde pouze 28 % částic bylo řádově nanorozměrných, výrazně omezuje jejich absorpci podél střeva. Za zmínku stojí, že ve skupině myší Ref-Au nebyla pozorována žádná významná změna ve střevní propustnosti nebo příjmu potravy, což naznačuje, že absorpce NP nevedla ke ztrátě integrity epiteliální bariéry nebo vyšší spotřebě zlata během léčby. Na druhou stranu relativně nízký výskyt signálů Au v Játra myší vystavených Ref-Au naznačovala omezenou jaterní retenci NP po denní expozici po dobu 90 dnů prostřednictvím potravy. To je v souladu s předchozí biodistribuční studií Au-NP modelů u potkanů, která prokázala nízkou systémovou absorpci s elementárním zlatem vylučovaným převážně stolicí [35].

Vzhledem k dobře známým antibakteriálním vlastnostem elementárního zlata [51] je možné, že akumulace Au v lumen trávicího traktu po dlouhodobé expozici E by mohla změnit střevní mikrobiotu, a to jak v jejím mikrobiálním složení, tak v metabolické aktivitě. Střevní mikrobiota hraje klíčovou roli v několika životně důležitých funkcích, jako jsou trávicí, metabolické a imunitní funkce [50], ale této důležité složce gastrointestinálního traktu se po chronické expozici jedlému zlatu nedostalo žádné pozornosti. V naší studii hlavní souřadnicová analýza provedená na celkových datech ukázala, že Složení bakteriální komunity se významně lišilo mezi samci a samicemi myší, bez ohledu na stav léčby, tj. včetně neléčených (kontrolních) skupin. Tento výsledek je plně v souladu s předchozími studiemi, které uváděly rozdíl mezi pohlavími ve složení mikrobioty [52