Recepty na potraviny tvořící aerobní spory

doi: /jx PŮVODNÍ VÝZKUM Tepelná odolnost aerobních spórotvorných látek izolovaných z potravinářských výrobků MARINA WITTHUHN, 1 * GENIA LÜCKING, 2 ZEYNEP ATAMER, 1 MONIKA EHLING-SCHULZ 3 a JÖRG HINRICHS 1 1 Katedra mlékárenské vědy a technologie, Institut potravinářských věd a biotechnologie, Universität Hohenheim, Garbenstr. 21, Stuttgart, Německo, 2Abteilung Mikrobiologie, Zentralinstitut für Ernährungs- und Lebensmittelforschung (ZIEL), Technische Universität München, Weihenstephaner Berg 3, Freising, Německo, a 3 Oddělení potravinářské mikrobiologie, Klinika pro přežvýkavce, Oddělení pro hospodářská zvířata a veřejné veterinářství, Univerzita veterinárního lékařství Vídeň, Vídeň, Rakousko Tepelná odolnost aerobních spórotvorných látek izolovaných z mléčných výrobků a kakaového prášku byla zkoumána s cílem poskytnout přehled o vyskytujících se vysoce odolný vůči teplu zárodečné buňky. Experimenty byly prováděny ve fosfátovém pufru při různých teplotách po dobu 30 minut. Dva kmeny Geobacillus pallidus přežily tepelné zpracování na C s logaritmickou redukcí a Kromě toho byla kinetika inaktivace jednoho z těchto kmenů (Bacillus amyloliquefaciens) stanovena pomocí modifikovaného Arrheniova modelu. Inaktivace následovala reakční pořadí 1 s rychlostní konstantou reakce (kref) ⁄ s při K a aktivační energií (Ea) kJ ⁄ mol. Klíčová slova Spory Bacillus, Bacillus amyloliquefaciens, Tepelná odolnost, Ultra vysokoteplotní léčba, Inaktivační kinetika. ÚVOD se do produktů mohou dostat neznámé spory s vysokou tepelnou odolností. Vzhledem k jejich vysoké tepelné odolnosti existuje riziko, že přežijí tepelné zpracování a povedou ke znehodnocení a tvorbě ⁄ nebo toxinů v konečném produktu. Důsledkem mohou být rizika pro spotřebitele, poškození image a ekonomické ztráty pro mlékárenský průmysl (Scheldeman et al. ), zejména pokud jde o produkty s prodlouženou trvanlivostí. Kromě toho v mlékárenském průmyslu existuje poptávka po výrobě potravin s prodlouženou trvanlivostí. Vysoce tepelně odolné látky tvořící spory (např. Bacillus sporothermodurans) nemusí nutně vést ke znatelnému znehodnocení (Hammer et al.). Spory však mohou během skladování klíčit a růst, což vede k tvorbě enzymů a metabolismu. Mikrobiální enzymy, jako jsou proteázy, lipázy a lecitinázy, jsou často zodpovědné za vady bez chuti a struktury. Typickými vadami jsou ploché kyselé kažení, kousavá smetana, sladké srážení, hořkost a žluklé a ovocné příchutě (Meer et al. ; Kalogridou-Vassiliadou ; Huis In't Veld ). Posouzení tepelné odolnosti bakteriálních spor je důležité pro navrhování průmyslových procesů. Zkoumání kinetiky inaktivace ve společnosti mlékárenské technologie Bakteriální spory jsou v přírodě všudypřítomné a jsou proto také přítomen v surovinách používaných k výrobě mléčných výrobků. Vzhledem k tomu, že spory obvykle přežívají procesy průmyslové pasterizace, lze je nalézt nejen v nesterilizovaných produktech, ale byla hlášena i kontaminace sterilizovaných produktů (Scheldeman et al.). Příklady kontaminovaných mléčných výrobků jsou odpařené mléko, mléko s ultra vysokou teplotou (UHT), mléko s prodlouženou trvanlivostí (ESL), tavené sýrové pomazánky, polotvrdé sýry a sušené mléko (Kalogridou-Vassiliadou ; Cosentino et al. ; Ronimus et al. ; Mayr et al. ; Quiberoni et al.). Několik studií ukázalo, že syrové mléko představuje důležitý zdroj kontaminace řetězců mlékárenské výroby; byly hlášeny počty spor až do CFU ⁄ ml (Crielly et al. ; Scheldeman et al. ). Mezi běžně se vyskytující druhy patří Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis a Bacillus cereus (Crielly et al. ; Cosentino et al. ; Mayr et al.). Méně pozornosti bylo věnováno v do přísad přidávaných do mléčných výrobků, jako je například kakaový prášek. S rostoucím mezinárodním obchodem se složkami, přesto Vol 64, č. 4 listopadu International Journal of Dairy Technology *Autor pro korespondenci. witthuhn@ sv. 64, č. 4 listopadové laboratorní váhy se často provádějí se šaržovými systémy při teplotách do C (Huemer et al. ; Iciek et al. ; Xu et al.). Průmyslové sterilizační procesy se však provádějí při vyšších teplotách s krátkými dobami ohřevu, jako je ohřev UHT s nepřetržitým průtokem. Použité parametry procesu tedy musí být vypočítány extrapolací ze zkoumaného teplotně-časového rozsahu. To může vést k účinkům, jako je nesterilita nebo nadměrné zpracování produktu. Pro získání přesnějších údajů je třeba zkoumat i vyšší teploty, například teploty používané v procesech kontinuální sterilizace. Byly představeny modely popisující mikrobiální inaktivaci [pro přehled viz studie Mafarta et al. ()]. Pro popis nelineární kinetiky inaktivace jsou vhodné různé modely, takže je třeba zvolit jeden model. V této studii byl k popisu mikrobiální inaktivace použit modifikovaný Arrheniův model. Tento model byl zvolen proto, že se osvědčil při popisu chemických reakcí a získané parametry lze v případě potřeby snadno převést na hodnoty D a z. Výpočet hodnoty D pro různé teploty je možný. Bez ohledu na použitý model je důležité vzít v úvahu vliv teploty nejen během doby zdržení, ale také během ohřevu a chlazení média. Zejména při vysokých teplotách a krátkých dobách ohřevu, např. ohřevu UHT, nejsou účinky doby ohřevu a chlazení zanedbatelné (Peleg et al. ). Tato studie byla provedena za účelem stanovení tepelné odolnosti aerobních spórotvorných látek izolovaných z mléčných výrobků a kakaa prášek poskytuje přehled o vyskytujících se vysoce tepelně odolných sporách. K dosažení tohoto cíle byla stanovena tepelná inaktivace vybraných kmenů při různých teplotách. Kromě toho byla podle Arrheniova modelu vypočítána kinetika inaktivace jednoho kmene, aby se posoudilo riziko selhání procesu v důsledku přežívajících spor. MATERIÁLY A METODY Bakteriální kmeny a podmínky růstu Kromě kmenů Bacillus a , které byly dříve získány výrobci potravin z jejich výrobního prostředí, byly všechny bakteriální kmeny použité v této studii izolovány ze vzorků mléčných výrobků a kakaového prášku (tabulka 1). Pro výběr potenciálně vysoce tepelně odolných látek tvořících spory byly vzorky zředěny Ringerovým roztokem (Merck, Darmstadt, Německo) (v závislosti na struktuře potravinové matrice mezi a ) a zahřívány po dobu 20 minut při teplotě C v autoklávu. Vzorky byly poté obohaceny infuzí mozku a srdce (BHI) vývar (Merck) doplněný o 1 mg ⁄ l vitaminu B12 (Merck) a inkubovaný při 30 a 55 ° C, v tomto pořadí, aby se získaly mezofilní a termofilní izoláty. Po inkubaci po dobu 24 hodin byly lL roztoku vzorku a příslušná desetinná ředění umístěna na agarové destičky BHI, které byly opět inkubovány při 30 a 55 °C. Morfologicky odlišné typy kolonií byly vybrány, purifikovány a identifikovány sekvenováním. Částečné sekvenování genů 16S rDNA a gyrA Genomová DNA byla připravena suspendováním buněk ve sterilní vodě a zahříváním vzorku po dobu 10 minut při teplotě C. Po Tabulka 1 Kmeny testované při screeningu tepelné odolnosti se zdrojem potravy. Podávají se sporulační média používaná k získání suspenzí spor: Druhové kmeny izolované po inkubaci při 30 °C, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Bacillus amyloliquefaciens, kmeny izolované po inkubaci při 55 °C, Geobacillus stearothermophilus, Geobacillus pallidus Bacillus licheniformis Aneurinibacillus thermoaerophilus Anoxybacillus flavithermus Bacillus thermoamylovorans Geobacillus pallidus Bacillus thermoamylovorans Geobacillus pallidus Anoxybacillus flavithermus SMa Kmen Zdroj potravy 10 Upravené mléko (před tepelným zpracováním) ESL čokoládové mléko Čokoládový dezert Neznámý 1 2 1 1 1 4 8 14 18 26 34 40 41 43 48 Sušené plnotučné mléko Syrové mléko Upravené mléko (před tepelným zpracováním) Sýrová pomazánka (zkažená) Sýrová pomazánka (zkažená) Čokoládové mléko (před ohřevem Kakaový prášek Kakaový prášek Kakaový prášek Sušené mléko 3 2 1 1 2 –b 1 3 3 3 SM, sporulační agarové médium. médium pro sporulaci. b Získaný v bujónu s infuzí mozku a srdce. Society of Dairy Technology Vol 64, č. 4 Listopadová centrifugace, supernatant byl použit jako templát pro genově specifickou PCR, která byla provedena tak, jak bylo popsáno výše (Ehling-Schulz et al. ). Fragmenty 16S rDNA byly amplifikovány pomocí následujících oligonukleotidů: 5¢AGAGTTTGATCCTGGCTC3¢ a 5¢CGGCTACCTTGTTACGAC3¢. Pro členy skupiny B. subtilis byly dodatečně použity gyrA oligonukleotidy (5¢CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT3¢ a 5¢CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT3¢) (Chun a Bae). Produkty PCR byly purifikovány pomocí purifikační soupravy QIAquick PCR (QIAGEN, Hilden, Německo) a komerčně sekvenovány (GATC Biotech, Konstanz, Německo). K nalezení nejpříbuznějších sekvencí z databáze byl použit nástroj BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) na webových stránkách Národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) (Altschul et al.). Příprava sporových suspenzí pro tepelné ošetření Bakteriální spory byly získány čtyřstupňovým postupem. Po inkubaci ve vývaru po dobu 24 hodin následovala inkubace na pruhové destičce po dobu 24 hodin, druhá inkubace ve vývaru a inkubace na sporulačním agarovém médiu (SM) po dobu 4–12 dnů, dokud nebylo sporulováno více než 70 % buněk. Standardní živný vývar I (Merck) a CASO agar (Roth, Karlsruhe, Německo) a BHI bujón a agar doplněné 1 mg ⁄ l filtrem sterilizovaného vitaminu B12 byly použity pro mezofilní a termofilní kmeny. Jako sporulační médium byly použity tři různé SM. Sporulační agarové médium 1 byla modifikací SM popsanou Doganem et al. (). Byl přidán jeden mililitr přípravku M MnCl2 (Merck). Složení SM 2 bylo založeno na SM studie Leightona a Doie (). Živný vývar byl nahrazen 10 g peptonu (Merck) a 6 g masového extraktu (Merck) a bylo přidáno 17 g agar-agaru (Roth). Obsah SM 3 byl dán Iciek et al. (). Použitá SM pro každý kmen byla zvolena na základě předchozích testů a lze ji nalézt v tabulce 1. Spory byly získány na povrchové kultuře v mm Petriho miskách. Biomasa byla z povrchu Petriho misek promyta sterilním studeným (2 £ C) fosfátovým pufrem [M KH2PO4 (Merck) + M K2HPO4 (Merck); pH]. Centrifugace při · g po dobu 7 minut při 2 C a promývání fosfátovým pufrem bylo provedeno pětkrát. Po tepelném ošetření při 80 °C po dobu 10 minut následovaly 1–3 další kroky praní. K získané suspenzi spor bylo přidáno 70 % etanolu, dokud nebylo dosaženo konečné koncentrace 35 % etanolu. Suspenze byly uchovávány při 2 °C po dobu 2–3 dnů v ethanolu, poté byly třikrát promyty a skladovány při 2 °C ve fosfátovém pufru. Konečný počet spor připravených suspenzí spor byl – cfu ⁄ ml. Tepelné zpracování Byl použit systém ohřevu vsázky popsaný Doganem et al. (). Tepelné zpracování bylo prováděno v trubkách z nerezové oceli se šroubovacím uzávěrem o objemu přibližně ml. Celý teplotní profil každého experimentu byl zaznamenán během zahřívání. Pro screening tepelného odporu byl jako dispergační médium pro spory použit sterilní fosfátový pufr (pH). Experimenty byly prováděny po dobu 30 minut v , a C. Inaktivace kinetika Bacillus amyloliquefaciens byla stanovena v ultrafiltračním permeátu (g ⁄ L, pH) vyrobeném ze sprejově sušené sušené sladké syrovátky (Bayolan PT; Bayerische Milchindustrie eG, Landshut, Německo; sušina g ⁄ g, bílkoviny g ⁄ g, tuk < g ⁄ g, laktóza – g ⁄ g, popel – g ⁄ g). Jako topné médium byl použit ultrafiltrační permeát pro simulaci inaktivace v mléce. Vzorky byly zahřívány z na C až na 35 min. Každý pokus s ohřevem byl proveden třikrát. Stanovení životaschopného počtu spor Vzorky byly zředěny Ringerovým roztokem a rozprostřeny na CASO agaru. Byly inkubovány při 30 a 55 ° C po dobu 96 hodin. Počet životaschopných buněk byl stanoven před a po tepelném zpracování. Kolonie byly spočítány po 24, 48 a 96 hodinách. Výpočet kinetických dat pomocí vylepšené metody Kinetická data pro inaktivaci B. amyloliquefaciens byla vypočtena pomocí Arrheniova modelu. Ten Byly uvažovány teplotní vlivy celého tepelného procesu včetně ohřevu a chlazení. V úvahu byly vzaty i reakční řády odlišné od 1 (Kessler ; MüllerMerbach et al. ). Ct Ea 1 1 1/4 exp kref exp t for n 1/4 1 C0 R T Tref ð1Þ Ct 1/4 1 þ ðn 1Þ kref C0 ð2Þ 1 1n Ea 1 1 n1 for n 1/4 6 1 exp t C0 R T Tref kde Ct je počet kolonií v čase t (cfu ⁄ ml), C0 je počáteční počet kolonií (cfu ⁄ ml), n pořadí reakce ()), kref rychlostní konstanta při referenční teplotě [1 ⁄ s nebo 1 ⁄ s (cfu ⁄ ml)1)n], t doba zdržení (s), Ea aktivační energie (J ⁄ mol), jsou univerzální plynová konstanta (J ⁄ (mol K)), T absolutní teplota (K) a Tref referenční teplota (K). Každý jednotlivý experiment vyústil ve funkci pro možná řešení. Oblast, ve které se funkce protínají, zahrnuje nejvhodnější řešení, které bylo vypočítáno iterací, čímž se minimalizuje součet čtverce chyb v logaritmické koncentraci pro všechny experimenty. Oblasti společné spolehlivosti byly vypočteny ze zjištěných hodnot pro log kref a Ea pomocí Eqn (3): p SSEa ; kref 1/4 SSbestfit F þ1 ð3Þ Np Society of Dairy Technology Vol 64, č. 4 listopadu, kde SSEa ; kref je součet čtvercových chyb pro příslušný parametr Ea a kref vypočítaný z logaritmické chyby koncentrace, SSbest-fit je minimální součet čtverců chyb logaritmické koncentrace vypočtené změnou Ea a kref, F je kritická hodnota rozdělení F, p stupně volnosti a N počet experimentů (Dogan et al. ). Čára stejného účinku v teplotně-časovém grafu pro 9 log inaktivace B. amyloliquefaciens byla vypočtena podle studie Kesslera (): lg t Ea 1/4 ð# #Þ t R T T ð4Þ kde t je doba výdrže (s), t* referenční doba zdržení (s), Ea aktivační energie (J ⁄ mol), R univerzální plynová konstanta ( J ⁄ mol ⁄ K), T absolutní teplota (K), T* referenční teplota (K), J teplota (C) a J* referenční teplota (C). Hodnota D byla vypočtena pomocí Eqn (5) (Kessler ): Dref 1/4 kref Strain 10 4 8 14 18 ð5Þ, kde Dref je hodnota D při referenční teplotě (s) a kref je konstanta reakční rychlosti při referenční teplotě (za sekundu). VÝSLEDKY A DISKUSE Identifikace a tepelná odolnost potravinářských izolátů Celkem bylo získáno 31 různých izolátů potenciálně vysoce tepelně odolných látkovačů vytvářejících spory z různých předehřátých (20 min, C) potravinových zdrojů, které obsahovaly sedm vzorků mléčných výrobků a tři vzorky kakaového prášku. Tabulka 1 ukazuje druhovou identifikaci 14 reprezentativních izolátů, které byly vybrány pro další experimenty s tepelnou inaktivací. Vyčištěné spory byly tepelně zpracovány při teplotách , a C po dobu 30 minut ve fosfátovém pufru v systému ohřevu šarže. Ten snížení počtu spor je uvedeno v tabulce 2. Byla vypočtena logaritmická redukce spor. Při C bylo 50 % kmenů (dva mezofilní a pět termofilních kmenů) inaktivováno; byly pod limitem detekce při 10 KTJ ⁄ ml. Rezistentní kmeny byly následně zahřáty na vyšší teploty. U C přežilo léčbu pět testovaných kmenů (dva mezofilní a tři termofilní). Po léčbě na C nebyly inaktivovány pouze dva kmeny Geobacillus pallidus (kmeny 8 a 40, tabulka 2) a vykazovaly také nejnižší logaritmickou redukci. V a C však B. subtilis vykazoval nejnižší logaritmickou redukci. Russel () uvedl, že spory teplomilných druhů jsou tepelně stabilnější než spory mezofilních druhů, což potvrzuje výsledky prezentované v této práci. Kromě dvou kmenů G. pallidus byly použity izoláty druhů B. subtilis, B. amyloliquefaciens a Aneurinibacillus thermoaerophilus ukázal detekovatelné kolonie (>10 CFU ⁄ ml) podle Society of Dairy Technology Tabulka 2 Výsledky screeningu tepelného odporu při indikované teplotě po dobu 30 min 26 34 40 41 43 48 Teplota ohřevu (C) Počáteční počet spor (cfu ⁄ ml) · · · · · � Počet spor po zahřátí (cfu ⁄ ml) Redukce log <10 · · <10 · · · <10 · <10 · · · <10 · · <10 <10 <10 · · · <10 · <10 <10 > > > > > > > > > > > ošetření při C po dobu 30 minut (Tabulka 2). Lze předpokládat, že tyto spory mohou někdy přetrvávat až do procesu průmyslové sterilizace, pokud je počáteční počet spor vysoký (viz obrázek 3). Mohly by tak způsobit problémy, jako je znehodnocení konečného produktu. Spory kmenů zde definovaných jako tepelně odolné přežily ošetření při C nebo vyšší po dobu 30 minut. Bylo prokázáno, že jsou přítomny tepelně odolné spory v mléčných výrobcích, jako je syrové mléko, sýry a čokoládové mléko ESL, a také v kakaovém prášku. Výskyt spor v syrovém mléce je dobře prozkoumán. Nejčastěji se vyskytují druhy B. licheniformis a B. cereus, ale byl hlášen i výskyt G. pallidus, B. amyloliquefaciens, B. subtilis a A. thermoaerophilus (Crielly et al. ; Scheldeman et al. ; Coorevits et al. ). Spory aerobních bakterií tvořících spory byly izolovány ze sýra a ESL mléka (Cosentino et al. ; Mayr et al. ; Quiberoni et al. ) a podílejí se na fermentaci kakaových plodů (Ardhana a Fleet ). Termorezistence spor nalezených v mléce byla analyzována poněkud podrobněji (Westhoff a Dougherty; Huemer et al. ; Janštová a Lukášová ), ale podle našich znalostí Vol 64, No 4 November bylo dosud provedeno jen málo výzkumů týkajících se tepelné odolnosti spor pocházejících z kakaového prášku. Druhy a druhy bacilů dříve patřící k Bacillus, jako jsou Geobacillus stearothermophilus a B. licheniformis, bylo zjištěno, že přežily pražení kakaových bobů při C po dobu 40 minut (Barille et al.). Bylo zjištěno, že Geobacillus pallidus izolovaný ze syrového mléka a z kakaového prášku je v této studii nejodolnější složkou vytvářející spory. Lze vyvodit závěr, že G. pallidus, pokud je přítomen v surovině, může být přítomen i v mléčném výrobku. Představuje tak hrozbu pro bezpečnost procesu, protože by mohl klíčit a růst. Pokud je nám známo, kažení potravin způsobené G. pallidus nebylo dosud popsáno. Je však známo, že spory G. stearothermophilus, dalšího termofilního kmene patřícího do stejného rodu, způsobují ploché kyselé kažení potravin s nízkým obsahem kyselin (Kalogridou-Vassiliadou ). Proto je možné, že G. pallidus také způsobuje kažení, pokud jsou teploty dostatečně zvýšené pro růst termofilních bakterií. Druhý žáruvzdorný kmeny v této studii byly druhu A. thermoaerophilus, B. amyloliquefaciens a B. subtilis. Poslední dva jmenované vykazují proteolytickou a lipolytickou aktivitu (De Jonghe et al. ) a A. thermoaerophilus hydrolyzuje protein (Meier-Stauffer et al.). Tyto aktivity naznačují potenciál způsobit kažení. Výsledky této studie ukazují, že vysoce tepelně odolné spórotvorné látky lze nalézt v různých mléčných výrobcích a v kakaovém prášku. V důsledku toho může dojít ke znehodnocení během skladování potravinářských výrobků. Ze skutečnosti, že spory byly izolovány z kakaového prášku, lze usoudit, že při navrhování sterilizačních procesů nestačí brát v úvahu pouze organismy pocházející z mléka, které se kazí. Přítomnost bakterií tvořících spory ve složkách je stále důležitější pro kvalitu míchaných mléčných výrobků a je třeba ji vzít v úvahu při úpravě procesů ohřevu. Dalším krokem bude určení počáteční spory Počet identifikovaných druhů vysoce odolných vůči teplu ve složkách mléčných výrobků a jejich enzymatické aktivity pro posouzení rizika kažení. Inaktivační kinetika B. amyloliquefaciens Protože se předpokládalo, že spory kmenů přežívající zahřívání na C po dobu 30 minut jsou schopny přežít i sterilizační proces, byl pro stanovení kinetiky jeho inaktivace vybrán jeden z těchto kmenů. Z rezistentních kmenů byl vybrán B. amyloliquefaciens kvůli své schopnosti růst při 30 °C a vysokému dosaženému výtěžku spor (>90 %). Enzymy produkované B. amyloliquefaciens jsou spojeny se kažením potravin (De Jonghe et al.). Navíc, pokud je nám známo, není k dispozici mnoho informací o kinetice inaktivace tohoto druhu. Kinetické parametry Obrázek 1 ukazuje výsledky inaktivace B. amyloliquefaciens v ultrafiltračním permeátu při teplotách v rozmezí od do C pro různé doby držení. Počáteční počet spor (a) (b) Obrázek 1 Inaktivace spor Bacillus amyloliquefaciens v systému ohřevu šarže. Topné médium: ultrafiltrační permeát. Teploty: C (d) C (s), C ( ), C (h) (a). C (.), C (,), C (¤), C ()) (b). Mez detekce: 10 KTJ ⁄ ml. před tepelným zpracováním · cfu ⁄ ml. U experimentů prováděných při vyšších teplotách (, , C) je vyšší počáteční počet spor 4 · cfu⁄ ml, aby ležely nad mezí detekce. U C nebyla B. amyloliquefaciens zcela inaktivována ani po době setrvání s (35 minut), zatímco u C došlo k inaktivaci asi 8 log po době zdržení 5 s. S pomocí počtu spor před a po tepelném zpracování a teplotních profilů experimentů s ohřevem byly stanoveny kinetické údaje pro inaktivaci B. amyloliquefaciens v ultrafiltračním permeátu pomocí Eqns (1) a (2). Pořadí reakce (n) byl vypočítán jako Bylo zjištěno, že rychlostní konstanta reakce (kref) při referenční teplotě K a aktivační energie (Ea) je ⁄ s a kJ ⁄ mol. Byly vypočteny společné oblasti spolehlivosti 90 % a 95 % pro parametry log kref a Ea, které jsou znázorněny na obrázku 2. Protože byla pozorována reakce prvního řádu, byly vypočteny D-hodnoty. The Society of Dairy Technology Vol 64, č. 4 Listopad Obrázek 2 Společné oblasti spolehlivosti 90 (- - -) a 95 % (—) pro parametry log kref a Ea. D C- a D C-hodnoty byly a 27 s, v tomto pořadí. Na základě získaných dat byla vypočtena čára stejného účinku pro deaktivaci logu 9 s Eqn (4). Výsledná čára (přerušovaná čára) je znázorněna na obrázku 3, což je obrázek pro tepelné ošetření mléka. Lze nalézt pouze několik dalších studií, ve kterých byla zkoumána inaktivace B. amyloliquefaciens pouze vlhkým teplem. O kinetice inaktivace B. amyloliquefaciens je k dispozici jen málo údajů, a většina studií určila pouze D-hodnotu (Ahn et al. ; Xu et al.). Z tohoto důvodu byly v této studii také vypočteny hodnoty D pro různé teploty. V mleté vaječné placičce byla aktivační energie pro inaktivaci B. amyloliquefaciens kJ ⁄ mol (Rajan et al. ). V této studii byla stanovená aktivační energie pro inaktivaci B. amyloliquefaciens , kJ ⁄ mol, nižší. Nízké aktivační energie pro inaktivaci spor byly hlášeny i v jiných studiích (Huemer et al. ; Dogan et al.). Ačkoli pořadí reakce pro inaktivaci vlhkým teplem nebylo uvedeno, inaktivační křivky B. amyloliquefaciens v mleté vaječné placičce byly podobně logaritmické lineární (Rajan et al.). Protože pořadí reakce bylo stanoveno na 1, byly vypočteny hodnoty D pro B. amyloliquefaciens, aby bylo možné porovnat tepelnou odolnost s jinými studiemi. Xu et al. () nalezli hodnotu D C pro inaktivace B. amyloliquefaciens vlhkým teplem v deionizované vodě je min. V jiné studii byly v deionizované vodě stanoveny hodnoty D C a D C tří kmenů B. amyloliquefaciens. Získané hodnoty byly – a – min pro hodnoty D C a D C (Ahn et al. ). Zdá se, že B. amyloliquefaciens má tepelnou stabilitu podobnou těm, které mají kmeny B. amyloliquefaciens zkoumané v jiných studiích. Je však třeba vzít v úvahu, že ke stanovení inaktivačních parametrů byla použita různá topná média, která mohou ovlivnit tepelnou odolnost. Bylo prokázáno, že nízké pH vede k rychlejší inaktivaci spor, zatímco cukry v topném médiu je chrání (Coroller et al. ; Bahçeci a Acar ). Society of Dairy Technology Obrázek 3 Graf teplota–čas pro tepelné ošetření mléka. Přerušovaná čára: inaktivace Bacillus amyloliquefaciens pro 9-log. HTST, vysoká teplota krátkodobá; LTLT, nízký teplota po dlouhou dobu; UHT, ultravysoká teplota. Upraveno podle studie Kesslera (). Čára stejného účinku Obrázek 3 ukazuje čáru stejného účinku pro 9 logaritmickou inaktivaci B. amyloliquefaciens v teplotně-časovém grafu pro tepelné ošetření mléka. Tento graf slouží jako pomůcka pro mlékárenský průmysl při výběru tepelného ošetření nezbytného pro pasterizaci nebo sterilizaci mléka. Pomocí tohoto grafu mohou výrobci přímo rozhodnout, zda určité ošetření teplotou a časem povede k nezbytné inaktivaci spor (např. protokol >9) nebo ne. Výhodou charakterizace inaktivačních účinků pomocí získaného inaktivačního poměru je, že popisuje inaktivaci bez ohledu na tvar křivky přežití (Mafart et al.). V mlékárenském průmyslu je inaktivace asi 9 log obecně považována za dostatečnou pro získání komerčně sterilního produktu (Kessler ). Referenční čára pro spory Destrukce znázorněná na obrázku určuje spodní hranici teplotně-časového ošetření sterilizovaných produktů. Ve zkoumaném teplotním rozsahu je B. amyloliquefaciens méně tepelně stabilní než referenční spory při teplotách do C. Při teplotách ohřevu od do C je tepelně stabilnější. Vyšší teploty nejsou pokryty experimenty v této studii; míra inaktivace Vol 64, č. 4 listopadu jsou odhadnuty se stanovenou kinetikou inaktivace. Lze dojít k závěru, že B. amyloliquefaciens má schopnost přežít procesy průmyslové sterilizace. Oblast UHT znázorněná na obrázku 3 ne vždy poskytne 9 logaritmickou inaktivaci B. amyloliquefaciens Schopnost přežít sterilizační procesy byla hlášena také u spor jiných druhů (Huemer et al.). V důsledku vysoké tepelné odolnosti musí být procesy ohřevu přizpůsobeny v závislosti na počátečním počtu spor a inaktivaci sazby, aby se zabránilo nesterilitě. Při určování inaktivačních parametrů mikroorganismu vlhkým teplem je třeba vzít v úvahu vliv fází ohřevu a chlazení procesu ohřevu na pozorovaný inaktivační účinek, zejména při vyšších teplotách (Peleg et al.). Topný efekt vyplývající z těchto stupňů je výraznější při krátkých dobách ohřevu. Zejména při UHT zpracování hraje doba ohřevu a chlazení důležitou roli pro dosažení potřebné inaktivace spor. Příklady teplotních profilů UHT procesů skutečně používaných v mlékárenské výrobě uvedli Tran et al. (). V průmyslových nepřímých UHT elektrárnách trvalo zahřátí až s, zatímco doba zdržení trvala jen několik sekund. Kromě toho uvedli, že ve většině těchto nepřímých UHT elektráren bylo více než 50 % pozorovaných bakteriologických účinků připisováno topným a chladicím částem systému. Z tohoto důvodu je pro přesnou předpověď deaktivace nezbytné zohlednění teplotních profilů pro výpočet kinetiky deaktivace. V této práci byly časy ohřevu a chlazení uvažovány jako součást experimentu ohřevu a byl brán v úvahu jejich příspěvek k rychlosti inaktivace. Bylo možné provádět experimenty s velmi krátkými prodlevami při vysokých teplotách a následně rozšířit zkoumaný teplotní rozsah směrem k vyšším teplotám, které leží v rozsahu UHT úprav. Navíc pro experimentální design nebylo nutné pokoušet se provádět izotermické nebo téměř izotermické experimenty. ZÁVĚR V této studii byla stanovena tepelná odolnost aerobních spórotvorných látek izolovaných z mléčných výrobků a kakaového prášku. Tepelně odolné kmeny byly izolovány z různých potravinářských výrobků a identifikovány částečným sekvenováním genů 16S rDNA a gyrA. Čtrnáct reprezentativní kmeny byly testovány na svou tepelnou odolnost, z nichž G. pallidus byl tepelně nejodolnějším druhem. Výsledky poukazují na to, že tepelně odolné spory si mohou také najít cestu do mléčných výrobků prostřednictvím přísad, jako je kakaový prášek. Kinetika inaktivace jednoho kmene B. amyloliquefaciens byla stanovena pomocí Arrheniova modelu. Inaktivace následovala po reakčním pořadí 1 s rychlostní konstantou reakce (kref) ⁄ s (Tref = K) a aktivační energií (Ea) kJ ⁄ mol. Zde představený nový přístup umožňuje stanovení kinetických dat z experimentů s neizotermickým ohřevem až do C pro krátké doby ohřevu. Výsledky této studie naznačují riziko vyššího podílu nesterilních produktů v důsledku výskytu zkoumaných tepelně odolných bakterií tvořících spory při vysokých koncentracích spor. PODĚKOVÁNÍ Tento výzkumný projekt byl podpořen FEI (Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.V., Bonn), AiF a Ministerstvo hospodářství a technologie (číslo projektu: AiF N). ODKAZY Ahn J, Balasubramaniam V M a Yousef A E () Inaktivační kinetika vybraných aerobních a anaerobních bakteriálních spor pomocí tepelného zpracování za asistence tlaku. Mezinárodní žurnál potravinářské mikrobiologie - Altschul S F, Gish W, Miller W, Myers E W a Lipman D J () Základní nástroj pro vyhledávání místního zarovnání. Časopis molekulární biologie - Ardhana M M a Fleet G H () Mikrobiální ekologie fermentace kakaových bobů v Indonésii. Mezinárodní žurnál potravinářské mikrobiologie 86 87– Bahçeci KS a Acar J () Modelování kombinovaných účinků pH, teploty a koncentrace kyseliny askorbové na tepelnou odolnost Alicyclobacillus acidoterrestis. Mezinárodní žurnál potravinářské mikrobiologie - Barille JC, Ostovar K a Keeney P G () Mikroflóra kakaových bobů před a po pražení v C. Časopis mléčné a potravinářské technologie 34 - Chun J a Bae K S () Fylogenetická analýza Bacillus subtilis a příbuzných taxonů založená na dílčích sekvencích genu gyrA. Antonie van Leeuwenhoek, Mezinárodní žurnál obecné a molekulární mikrobiologie 78 – Coorevits A, De Jonghe V, Vandroemme J, Reekmans R, Heyrman J, Messens W, De Vos P a Heyndrickx M () Srovnávací analýza rozmanitosti aerobních bakterií tvořících spory v syrovém mléce z ekologických a konvenčních mléčných farem. Systematická a aplikovaná mikrobiologie 31 – Coroller L, Leguérinel I a Mafart P () Vliv vodních aktivit ohřívacího a regeneračního média na zdánlivou tepelnou odolnost spor Bacillus cereus. Aplikovaná a environmentální mikrobiologie 67 – Cosentino S, Mulargia A F, Pisano B, Tuveri P a Palmas F () Výskyt a biochemické charakteristiky Bacillus flora v sardinských mléčných výrobcích. Mezinárodní žurnál potravinářské mikrobiologie 38 - Crielly E M, Logan NA a Anderton A () Studie o Bacillus flóry mléko a mléčné výrobky. Časopis aplikované bakteriologie 77 – De Jonghe V, Coorevits A, De Block J, Van Coillie E, Grijspeerdt K, Herman L, De Vos P a Heyndrickx M () Toxinogenní a kažený potenciál aerobních spórotvorných látek izolovaných ze syrového mléka. Mezinárodní žurnál potravinářské mikrobiologie – Dogan Z, Weidendorfer K, Müller-Merbach M, Lembke F a Hinrichs J () Inaktivační kinetika spor Bacillus v dávkových a kontinuálních systémech ohřevu. LWT-Potravinářská věda a technologie 42 81– Ehling-Schulz M, Vukov N, Schulz A, Shaheen R, Andersson M, Märtlbauer E a Scherer S () Identifikace a částečná charakterizace genu neribozomální peptidové syntetázy zodpovědného za cereulide Society of Dairy Technology Vol 64, č. 4 listopadová produkce v emetickém Bacillus cereus. Aplikovaná a environmentální mikrobiologie 71 – Hammer P, Lembke F, Suhren G a Heeschen W () Charakterizace tepelně rezistentních mezofilních druhů Bacillus ovlivňujících kvalita UHT mléka – předběžná zpráva. Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte 47 – Huemer I A, Klijn N, Vogelsang H W J a Langeveld L P M () Kinetika tepelné smrti spor Bacillus sporothermodurans izolovaných z UHT mléka. Mezinárodní mléčný žurnál 8 – Huis In't Veld J H J () Mikrobiální a biochemické kažení potravin: přehled. Mezinárodní žurnál potravinářské mikrobiologie 33 1 – Iciek J, Papiewska A a Molska M () Inaktivace spor Bacillus stearothermophilus během tepelného zpracování. Journal of Food Engineering 77 – Janštová B a Lukášová J () Tepelná odolnost spor Bacillus spp. izolovaných z kravského mléka a prostředí farmy. Acta Veterinaria Brno 70 – Kalogridou-Vassiliadou D () Biochemické aktivity druhů Bacillus izolovaných z plochého kyselého odpařeného mléka. Journal of Dairy Science 75 – Kessler H G () Potravinářské a bioprocesní inženýrství – München: Verlag A. Kessler. Leighton T J a Doi R H () Stabilita messengerové ribonukleové kyseliny během sporulace u Bacillus subtilis. Časopis biologické chemie – Mafart P, Leguérinel I, Couvert O a Coroller L () Kvantifikace odolnosti spor pro hodnocení a optimalizaci procesů ohřevu: nekonečný příběh. Potravinářská mikrobiologie 27 – Mayr R, Gutser K, Busse M a Seiler H () Domácí aerobní reformátory ve vysoce tepelně zpracovaném (C, 5 s) německém ESL (prodloužená trvanlivost) mléce. Milchwissenschaft 59 – Meer R R, Baker J, Bodyfelt F W a Griffiths M W () Psychotrofní Bacillus ssp. v tekutých mléčných výrobcích: recenze. Journal of Food Protection 54 – Meier-Stauffer K, Busse H J, Rainey F A, Burghardt J, Scheberl A, Hollaus F, Kuen B, Makristathis A, Sleytr U B a Messner P () Popis Bacillus thermoaerophilus sp. nov., aby zahrnoval izoláty cukrové řepy a Společnost mlékárenské technologie Bacillus brevis ATCC International Journal of Systematic Bakteriologie 46 – Müller-Merbach M, Neve H a Hinrichs J () Kinetika tepelné inaktivace bakteriofága Lactococcus lactis P Journal of Dairy Research 72 – Peleg M, Normand MD, Corradini M G, Van Asselt A J, De Jong P a Ter Steeg P F () Odhad parametrů tepelné odolnosti bakteriálních spor z jejich poměrů přežití na konci UHT a dalších tepelných úprav. Kritické recenze v potravinářské vědě a výživě 48 – Quiberoni A, Guglielmotti D a Reinheimer J () Nové a klasické bakterie kažení způsobující rozšířené foukání v argentinských měkkých a polotvrdých sýrech. Mezinárodní žurnál mlékárenské technologie 61 - Rajan S, Ahn J, Balasubramaniam V M a Yousef A E () Kombinovaná kinetika tlakově-tepelné inaktivace spor Bacillus amyloliquefaciens v mletém vaječném placičkovi. Časopis ochrany potravin 69 – Ronimus R S, Parker L E, Turner N, Poudel S, Rückert A a Morgan H W () Srovnání termofilních látek založené na RARD bacily ze sušeného mléka. Mezinárodní žurnál potravinářské mikrobiologie 85 45 – Russel A D () Zničení bakteriálních spor, str. 31 – Londýn: Academic Press. Scheldeman P, Pil A, Herman L, De Vos P a Heyndrickx M () Výskyt a rozmanitost potenciálně vysoce tepelně odolných spor izolovaných na mléčných farmách. Aplikovaná a environmentální mikrobiologie 71 – Scheldeman P, Herman L, Foster S a Heyndrickx M () Bacillus sporothermodurans a další vysoce tepelně odolné látky tvořící spory v mléce. Časopis aplikované mikrobiologie – Tran H, Datta N, Lewis M J a Deeth H C () Předpovědi některých parametrů produktu na základě podmínek zpracování mléčných závodů s ultra vysokou teplotou. International Dairy Journal 18 – Westhoff D C a Dougherty S L () Charakterizace druhů Bacillus izolovaných ze zkaženého mléka zpracovaného ultravysokou teplotou. Časopis mlékárenské vědy 64 - Xu H, He X, Gou J, Lee H Y a Ahn J () Kinetické hodnocení Fyziologická heterogenita bakteriálních spor během tepelné inaktivace. Časopis obecné a aplikované mikrobiologie 55 –